耐药基因的检测

答：ESBLs主要包括：SHV，TEM，CTX-M（及Toho），OXA，PER，VEB，BES等类型。

答：每一类ESBLs，可设计一个通用引物进行PCR检测，实际检测时可以参照部分文献中提供的引物，常用的引物见表5-1-1。PCR体系：50μl，其中buffer 5μl，dNTP 4μl，引物各0.25μl，聚

答：根据其氨基酸序列的同源性，可以将CTX-M 型ESBLs大致分成五组，第一组包括CTX-M-1，-3，-10到-12，-15，-22，-23，-28，-29和CTX-M-30；第二组包括CTX-M-2，-4到-7，-20和Toho-1；第三组包括CTX-M-8

答：根据五组CTX-M型ESBLs的氨基酸同源性，可以设计相应的通用引物进行检测。具体的引物及反应条件见表：PCR所用引物及其扩增片段和退火温度

答：对于表型研究中怀疑或者确认有ESBL的细菌，可以先用每一类ESBLs的通用引物进行PCR扩增，然后选取相应的测序引物（下表）进行PCR扩增及测序，将测序所得序列进行比对后确认其基因型

答：AmpC酶分为染色体介导AmpC酶和质粒介导AmpC酶。根据染色体AmpC酶的表达模式可分为诱导型AmpC酶和结构型（持续高产）AmpC酶。

答：相对于染色体AmpC酶来说，质粒AmpC酶具有可传递性和持续高水平表达，增加了耐药性传递的可能性，也增加了临床用药的难度。

答：天然缺乏AmpC结构基因的细菌，如：克雷伯菌属、奇异变形杆菌和沙门菌属；缺乏AmpR、由弱启动子和衰减机制调控而低水平表达的大肠埃希菌。

答：目前质粒AmpC酶已经有40多种，根据氨基酸的同源性及进化树分析，将其分为六群：来源于枸橼酸杆菌的CIT群；来源于阴沟肠杆菌的EBC群；来源于摩根摩根菌的DHA群；来源于蜂房哈夫尼亚菌

答：表型检测不能区分染色体AmpC酶和质粒AmpC酶，只能通过分子生物学方法才能确认质粒AmpC酶的存在。

答：质粒AmpC酶可以通过多重PCR进行初步检测，以确定质粒AmpC酶所属群，然后可以通过型特异引物PCR及测序确定其准确的型别。

答：根据质粒ampC基因的分群，设计具有群特异性的6对引物，放在同一PCR反应体系中进行扩增，在检测质粒AmpC酶的同时根据电泳条带的位置初步分群。

答：①热裂解提取DNA：取过夜纯培养细菌单一菌落，接种至5ml LB肉汤，37℃过夜培养，取1.5ml菌液转至Eppendorf管，13 200rpm离心5分钟，去上清，在沉淀中加入500µl双蒸水，95℃加热10分

答：质粒AmpC酶目前有40多个型别，对每个型别的PCR检测中，应该注意引物的特异性。自己设计引物需要一定的经验，所以最好是借用已得到公认的文献中的引物。退火温度：不同PCR仪的性能

答：目前KPC型碳青霉烯酶的型别已有14种，分别为KPC-2～KPC-15。我国主要是KPC-2型碳青霉烯酶。少数菌株产生KPC-3型碳青霉烯酶。

可采用PCR的方法检测KPC型碳青霉烯酶基因。PCR检测KPC及部分常见碳青霉烯酶所用引物见表：PCR检测部分碳青霉烯酶的引物

答：mecA基因是甲氧西林耐药葡萄球菌（MRS）特有的耐药基因，在其耐药性中起决定性的作用。葡萄球菌检出mecA基因或PBP2a即可定为MRS。PCR通过直接检测细菌染色体上的mecA基因来确证

答：MRS包括MRSA和MRSCN，多重PCR采用同时检测mecA基因和femA基因，或者mecA基因和凝固酶基因（coa gene），能准确区分MRSA 和MRSCN。所用引物见表5-1-6，反应条件见相关文献。

答：除了使用PCR外，还可以使用核酸杂交技术和生物传感器等技术检测MRSA，此两类方法结果比较准确，但成本较高。

答：VRE耐药基因分为VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG、VanL、VanM及VanN等型。VanA型可被万古霉素和替考拉宁诱导且对二者高度耐药，VanB型只能由万古霉素诱导对万古霉素耐

答：①细菌总DNA抽提：将细菌接种在LB液体培养基中，35℃摇床过夜。取1.5ml菌液倒入Eppendorf管中，12 000r/min离心5分钟，弃上清液，用100μl裂解液（内含25μg溶菌酶）将细菌重悬，混匀