三、目的基因与线性化载体的体外连接

根据目的基因和线性化载体末端的特点，可采用如下不同的连接策略。如果目的基因末端为平端，便可在T4 DNA连接酶的作用下，将人工接头加在目的基因的平端上，然后用相应的限制性内切酶切割人工接头产生黏端，进而连接到用相同限制性内切酶线性化的载体上。针对目的基因的5 ′和3 ′端，设计一对特异引物，在每条引物的5 ′端分别加上不同的限制性内切酶位点，然后以目的基因为模板，经PCR扩增便可得到带有引物序列的目的基因，进而用相应限制性内切酶切割PCR产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。可采 ......